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二代测序 (NGS) 是分子生物学实验室的必要工具，可在多种基础、转化和临床研究环境中用于分析核酸样品。样品文库制备是 NGS 工作流程中的关键步骤，不仅耗时费力且成本较高。对制备过程中间步骤的起始样品，以及对测序之前的最终文库进行质量控制 (QC)，可识别质量较差或浓度不足的样品，确保获得成功的序列数据，有助于节省时间和资源。样品质量信息还可帮助排除故障或优化文库制备方案。
一般而言，制备 NGS 文库所需的步骤包括起始样品的片段化、平台特异性测序接头与样品的连接以及扩增文库以产生足够的测序材料。由于最终测序结果的质量高度依赖于文库的质量，因此在整个文库制备工作流程的各个节点进行 QC 检查有很大帮助。建议在开始文库制备方案之前以及片段化、接头连接、序列捕获后或得到最终文库之后进行 QC 检查（图 1）。QC 检查可提供有关样品大小、浓度和完整性的有价值的信息，高质量样品对于成功测序必不可少。
图 1. 在 NGS 文库制备过程中建议进行质量控制的步骤
NGS 文库制备中起始材料的质量控制



文库制备过程中最重要的 QC 步骤之一发生在 NGS 工作流程开始之前。这一关键 QC 步骤就是分析要使用的起始材料，无论是 DNA 还是 RNA。确保高质量的起始材料是制备高质量文库并获得成功测序结果的第一步。大多数 NGS 文库制备试剂盒建议使用特定的起始浓度和起始量，以获得最佳测序结果。如果起始材料降解或质量较差，可能会难以甚至无法利用样品创建文库。一些研究考察了样品质量和下游分析之间的相关性。

整个 NGS 文库制备过程的质量控制





确定了用于 NGS 文库制备的合适样品后，需采取多个步骤将其转变为用于测序的合适文库。为了获得良好可靠的测序数据，强烈建议在工作流程中多个环节设置 QC 检查点，以确保创建高质量文库。检查点中包括片段化和接头连接后的样品 QC。



图 2. 使用安捷伦 TapeStation 系统对接头连接进行 QC。(A) 插入片段（红色）和双链接头（蓝色）的示意图；(B) 由单链 DNA 组成的双链接头的电泳图，在 75 bp 处显示有一个峰；(C) 165 bp 为起始 DNA；(D) 使用 B 和 C 作为参照，连接后 QC 中显示的四个峰经鉴定为未连接接头、未连接的插入片段，单端连接产物和双端连接产物。PCR 后带有双端接头的 165 bp 插入片段的样品谱图 (E) 和 (F) 示意图。
最终 NGS 文库的质量控制
文库制备的最后一步是 PCR 扩增，可捕获连接接头的片段，并生成足够的文库拷贝用于测序。此步骤还可以用于添加标签，以在单次测序运行中对多个样品进行多重检测。尽管最终文库的分子量和形状取决于所使用的文库制备试剂盒，但使用任何一种自动化电泳平台均可对所有类型的文库进行可视化和分析。除文库弥散峰以外的任何其他峰均表明存在过量的引物或接头二聚体。此阶段的分析还有助于确定文库扩增是否过度或不足，并利于混合文库以进行测序。最终文库的 QC 可确保高质量的制备，并可确定文库的分子量、浓度和摩尔浓度。

安捷伦自动化电泳产品系列提供了多种用于核酸 QC 分析的仪器，包括生物分析仪系统、片段分析仪系统、TapeStation 系统和 Femto Pulse 系统。自动化电泳仪非常适合在整个 NGS 文库制备过程中测定样品的分子量大小、浓度和摩尔浓度，已在科学文献中广为引用。

来源：公众号【安捷伦诊断与基因组学】

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