NGS 质控系列文章——RNA 样本质控
RNA 测序需要高质的RNA 作为起始材料，但是，RNA 属于易降解的生物分子，储存温度、冻融操作、提取方法以及广泛存在的 RNA 酶都会影响 RNA 的完整性，这使得对起始 RNA 样本的质量控制成为了高灵敏度下游应用之前的关键步骤。根据最新发布的国标 GB/T 40664-2021《用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求》指示，RNA 完整性可通过生物分析仪系统提供的 RNA 完整值 (RIN) 以及其他自动化电泳仪器开发的等效质量指标来评估。TapeStation 系统的RNA 完整值当量 (RINe) [1]，或片段分析仪和 Femto Pulse 系统的 RNA 质量值 (RQN) [2]均是衡量RNA完整性的理想工具。每个 RNA 质量指标均考虑了 RNA 样品的整个电泳分离过程，包括核糖体片段的比例以及是否存在降解产物。
该次国标的发布，明确了用于下游 NGS 检测的不同类型 RNA 样本对完整性数值的要求，正如许多测序实验室都认为的高质量人源 RNA 的 RIN 评分不应低于 7.0，植物、真菌总 RNA 的 RIN 不应低于 5，原核生物 RNA 应 ≥6。
表1：不同物种的总 RNA 完整性要求
对于其它应用，研究者可能会自行研究以建立样品质量标准，并用于工作流程。例如，Haller 等[3] 使用多种方法评估了几种 RNA 样品，将样品分类为“通过” 或“失败”，以表明样品是否能够用于下游微阵列芯片和 qRT-PCR 实验。在这些分析方法中，RIN 考虑了两个核糖体条带信号强度的降低，以及在两个峰之间和 18S 条带以下短片段数量的增加。采用 RIN 评分可在不受人为因素影响的可靠自动化流程中，用为实现 RNA 质量控制标准化的工具。该研究中每个“通过” 等级的样品 RIN 均不低于 6.6，平均值为 7.5（参见文献）[3]。随着 NGS 技术的发展，较高的 RIN 通过值也被用以确保成功的文库制备和测序结果。
RIN 因其高引用率已经被视为 RNA 质控的金标准，安捷伦公司进一步又开发了 RINe [1] 和 RQN [2]，它们已经被证明与 RIN 具有等效性。通过提供有关样品完整性的信息，RNA 质量指标使用户能够就如何处理不理想的样品做出明智的决策。这些决策包括如何针对略微降解的样品优化实验方案。Alpern 等[4] 旨在改进一种独特的 RNA 测序方法的现有方案：批量 RNA 加标签测序 (BRB-seq)。在对方法进行改进后，作者使用片段分析仪系统评估了起始 RNA 完整性和得到的 NGS 文库的质量。将 RNA 样品进行不同程度的碎片化，并使用 BRB-seq 进行分析，以评估差异基因表达。如图所示（图 1），RQN 随着 RNA 碎片化程度的增加而下降。
图 1. 为了评估片段化 RNA 的 BRB-seq 性能，有意将样品降解 1–2 分钟。使用安捷伦片段分析仪系统评估 RNA，并比较完整样品（NT：绿色峰图）和降解样品（1 分钟：蓝色峰图；2 分钟：红色峰图）的 RQN。T0：前脂肪细胞。此图转载自 Alpern 等[4] 并经过修改。
越来越多的实验室开始对低质量样品或由于提取方法或储存条件而导致轻微降解的样品进行测序。FFPE 可以保护细胞结构和组织形态，是保存样品供后续使用的常见方法。但是，该方法也会带来复杂性（例如对核酸的化学修饰），使样品难以进行 NGS 分析。自动化电泳仪可通过 DV200 指标对 FFPE RNA 进行质量评估，该指标专门用于检测样品中大于 200 nt 的 RNA 的百分比，被作为 FFPE 来源 RNA 降解程度的指标。根据 DV200 评分，研究人员可以决定是否需要改良以及如何改良其 NGS 工作流程。常见的调整包括增加或减少剪切时间以获得理想的分子量，或排除质量不佳可能无法使用的样品。
例如，Wimmer 等[5] 使用生物分析仪提供的 DV200 评估了来自大鼠、人和小鼠的几种新鲜冷冻 (FF) 和 FFPE RNA 样品的质量，并使用微阵列芯片和 RNA 测序对样品进行了比较。如电泳图（图 2）所示，大鼠 FF 样品显示清晰的 18S 和 28S 峰，平均 RIN 为 6.1。相反，来自 FFPE RNA 的 rRNA 峰无法区分，样品表现为较大的平缓峰，RIN 为 2.3，表明 RNA 已降解。平缓峰范围较宽，覆盖 100–4,000 nt，表明存在一些长 RNA 片段。作为替代方法，使用 DV200 评分衡量样品质量，尽管 FFPE 样品的平均 DV200 评分为 76%，远低于 FF 样品的 97%，但此评分表明该材料仍然可用于 Illumina 测序 (DV200 > 70%)。
图 2. 在安捷伦生物分析仪系统上分析了由大鼠 (r) 显微切割样品制备的 (A) 新鲜冷冻 (FF) 和 (B) FFPE RNA 样本。(C) 报告了多个样品的 RIN 和 DV200 数值，以评估样品质量。此图转载自 Wimmer 等并经过修改。
基于 RIN（或等效数值）的 RNA 完整性分析虽然常用于新鲜样品和冷冻样品，但无法可靠地应用于 FFPE 材料，因为福尔马林固定会导致所有 RNA 发生片段化。相反，DV200（长度超过 200 个核苷酸的 RNA 片段百分比）可以成为可行的替代方法。研究报告显示，DV200 大于 70% 表明为高质量 RNA；介于 50%– 70% 之间为中等质量 RNA 样品，但需要使用更高的起始样本量进行转录组分析；DV200 值低于 30% 表明 RNA 样品已严重降解，无法用于进一步实验。在该研究中，尽管组织样本起始量非常低，但依然可以通过 DV200 值识别出能够满足 RNA 测序建议的阈值 [5]。DV200 评分使作者能够从原本可能被丢弃的样品中识别出可用于测序的样品。
安捷伦自动化电泳仪提供了一系列试剂盒，可兼容多种样品类型和分子量，提供准确可靠的分子量测定、定量和摩尔浓度。此外，每种仪器均采用专为平台优化的特定质量指标，可对样品完整性进行客观评估。尽管不同类型的仪器质量指标的计算有所不同，但最终的质量评分在不同平台间具有很高的可比性。大量文献证明自动化电泳仪非常适合这类重要的质控步骤，不仅适用于传统的 NGS 文库制备，还可用于故障排除和方案优化，以及为复杂或独特样品开发定制工作流程。
